吳昊團隊開發高通量檢測單細胞mRNA動態變化的新技術scNTseq細胞命運轉變以及響應外界信號的過程中會改變細胞類型特異（cell-type-specific）的基因表達，而基因表達的豐度(total RNA level)是由mRNA轉錄、加工、降解等過程共同決定的。在含有多種細胞類型的復雜組織和系統中，

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在單細胞水平準確測定這些 mRNA動態變化過程對于理解基因表達調控的重要性不言而喻。傳統的mRNA代謝標記技術利用尿□類似物4-硫尿□（4sU）可以有效的標記新生mRNA，但是技術上的局限性不能達到單細胞分辨率；而常規單細胞轉錄組測序技術雖然可以揭示不同細胞類型的穩態轉錄組，但是不能精確分辨特定時間裡新生成的和已有的mRNA，因此用于定量研究細胞類型特異的mRNA動態調控機制十分困難。為了應對這一挑戰，美國賓夕法尼亞大學吳昊實驗室開發了一種高通量檢測單細胞mRNA動態變化的新方法錛 scNT-seq（全稱single-cell metabolically labeled new RNA tagging sequencing）。該方法創新性的整合了mRNA代謝標記 (metabolic labeling)，基于液滴微流控（droplet microfluidics）的高通量單細胞轉錄組分析技術和最近開發的4sU化學轉化反應 （chemically recode 4sU to cytosine analog ）[ref 1]；在數據分析方面，作者構建了基于unique molecular identifier (UMI) 的統計模型來更加準確地分析單細胞水平上新生成的mRNA的比例。北京時間2020年8月31日晚23時，Nature Methods雜志在線發表了文章 “Massively parallel and time-resolved RNA sequencing in single cells with scNT-seq”。作者應用這一技術解析了小鼠神經元快速激活過程中的單細胞基因調控網絡並預測細胞狀態變化軌蹟，他們還進一步研究了不同胚胎幹細胞狀態轉換過程中的mRNA動態變化的調控機制。 圖1 scNT-seq的流程圖。scNT-seq具體技術流程如下：首先將4sU添加到培養基中用來標記細胞中新生成的mRNA（圖1第1步）。為了在單細胞轉錄組中區分含有4sU標記的轉錄本，將4sU化學轉化反應整合到液滴微流控 (Drop-seq) [ref 2]流程中（圖1第2-4步）。由于捕獲mRNA的barcoded beads具有區分不同轉錄本的UMI序列，相比較沒有UMI的單細胞分析技術（e.g. scSLAM-seq）[ref 3]，該方法不僅可以消除由于PCR擴增帶來的誤差，

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而且相對于單個mRNA分子而言能增加T-to-C的覆蓋度（圖1第5-8步）。最後，利用基于UMI的二項式混合分布來準確估計每個細胞中單個基因的新生轉錄本。（圖1第9步）圖2 利用scNT-seq技術研究小鼠大腦皮層神經元中神經活性調控的轉錄動態。前人的研究表明，神經元激活後可以快速誘導（幾分鐘到幾小時內）幾百個特異基因表達，這些基因被稱為神經活性調節的基因（Activity-regulated genes錛 ARGs）。利用ARGs被神經活性快速誘導而在靜息狀態下幾乎不表達的特點，可用其評估scNT-seq技術檢測新生成mRNA的可靠性。作者用4sU標記原代培養的小鼠大腦皮層神經細胞，其間用氯化鉀（KCl）激活這些細胞（15-120分鐘）（圖2a）。作者首先將大腦皮層神經元聚類成不同細胞類型，包括興奮性神經元（Ex）、抑制性神經元 (Inh)、神經元前體細胞（NP）等（圖2b）。接下來他們分析了不同細胞類型中，ARGs基因中（如Jun和Npas4基因，圖2c）新（new RNAs，產生于4sU標記的2小時內）和舊（old RNAs，產生于2小時前）轉錄本在不同細胞類型中的表達水平。這些ARGs的new RNAs在不同細胞類型中有不同程度的響應，而old RNAs沒有明顯響應（合成于4sU標記和神經元激活前），說明scNT-seq可以準確區分新舊轉錄本。在準確區分新、舊轉錄本的基礎上，作者運用新近開發的Dynamo算法程序在興奮性神經元中進行了基于mRNA代謝標記的RNA velocity分析（圖2d右側），能準確捕獲神經元激活早期（0 C 15min）和晚期（30 C 120 min）的變化。相較之下，傳統的RNA velocity利用已拼接（無內含子）和未拼接（有內含子）的轉錄本信息來間接地預測細胞中基因表達的變化趨勢。由于Jun錛 Fos等早期響應基因內含子長度較短，基于內含子/外顯子定量的傳統RNA velocity方法無法準確估計這些基因的動態變化，因此無法鑑定到神經元激活早期（0 C 15min）的變化 (圖2d左側）。而基于新生成轉錄本的RNA velocity能夠直接利用實驗準確定量的新、舊轉錄本的信息，推測mRNA的動態變化，不受基因結構（內含子比例）影響，兼具準確性和適用性。 圖3 利用scNT-seq技術研究小鼠胚胎幹細胞不同細胞狀態的mRNA豐度調節策略。細胞中RNA的豐度由轉錄、加工、降解等過程共同決定，準確測定細胞群體中稀有或動態變化的細胞類型中mRNA合成和降解速率是一個重要而充滿挑戰的問題。前人的研究表明，小鼠胚胎幹細胞存在不同的幹細胞狀態，其中大約1%的細胞會自發轉變為具有更高分化潛力（totipotent）的“2C-like”狀態（2-cell embryos like state）。作者通過pulse-chase的標記策略結合scNT-seq技術測定了2616個基因在不同細胞狀態中的降解速率（half-life，圖3a錛b）。結合4小時4sU標記實驗，作者測定了445個差異表達基因的合成和降解速率。根據mRNA合成速率和降解速率在不同細胞狀態間變化的趨勢，這些基因可以劃分為3種不同的mRNA豐度調節策略（圖3c）。有意思的是，即使採用同一種調控策略的基因，mRNA合成和降解對于不同基因mRNA豐度調節的貢獻也不盡相同。例如Tet1和Lefty2基因都採用“Destabilizing”策略（mRNA合成和降解速率同向變化），但是Tet1基因主要通過降低合成速率（synthesis rate）降低2C-like細胞中mRNA豐度，而Lefty2基因主要通過提高降解速率（degradation rate）降低2C-like細胞中mRNA豐度（圖3c）。總的來說，scNT-seq是一種能在單細胞水平準確定量新生轉錄本的新技術。和已有的單細胞代謝標記分析方法[ref 3]相比，

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這項新技術兼具高準確度，高通量和低成本等優勢。因此，scNT-seq與Jay Shendure實驗室的曹俊越博士新近開發的sci-fate技術[ref 4]，都能夠廣泛應用于分析大量單細胞在細胞命運決定和分化，外界信號響應，及疾病模型等動態過程中mRNA表達調控等相關的重要生物學問題。 賓夕法尼亞大學吳昊教授為通訊作者，邱琦博士和胡鵬博士為共同第一作者。邱琦博士建立了scNT-seq文庫構建方法，胡鵬博士開發了scNT-seq數據分析流程，

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邱肖傑博士 （Whitehead Institute錛 https://github.com/aristoteleo） 在基于Dynamo的RNA velocity分析上提供了幫助。 原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41592-020-0935-4 參考文獻：1. Schofield錛 J. A.錛 Duffy錛 E. E.錛 Kiefer錛 L.錛 Sullivan錛 M. C. & Simon錛 M. D. TimeLapse-seq: adding a temporal dimension to RNA sequencing through nucleoside recoding. Nat. Methods 15錛 221C225 (2018).2. Macosko錛 E. Z. et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell 161錛 1202C1214 (2015).3. Erhard錛 F. et al. scSLAM-seq reveals core features of transcription dynamics in single cells. Nature 571錛 419C423 (2019).4. Cao錛 J.錛 Zhou錛 W.錛 Steemers錛 F.錛 Trapnell錛 C. & Shendure錛 J. Sci-fate characterizes the dynamics of gene expression in single cells. Nat. Biotechnol. https://doi.org/10.1038/s41587-020-0480-9 (2020).​祝賀MedComm被DOAJ數據庫收錄！DOAJ (Directory of Open Access Journals)于2003年在瑞典隆德大學創建。迄今為止，這個獨立的數據庫已經收錄了來自133個國家的15錛050本開放獲取期刊，包括5錛210錛674篇論文。DOAJ涵蓋各個學科，包括科學、技術、醫學、社會科學以及人文科學。經過DOAJ遴選的期刊，

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都是高質量的同行評審的開放獲取期刊。被DOAJ收錄後，在 MedComm上發表的所有論文的摘要和全文都可以被檢索到，並可以免費閱讀和下載。第一期鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/toc/26882663/2020/1/1 線粒體存在于所有真核細胞中，具有生物合成、能量產生和信號轉導等多種作用。線粒體功能異常在腫瘤發生發展中起重要作用，是近年來的研究熱點。同濟大學施裕豐教授團隊致力于線粒體代謝與腫瘤發生發展關系的研究，近期該團隊在Wiley發行的MedComm期刊發表綜述文章。文章介紹了當前人們對線粒體在腫瘤細胞中功能和作用的最新認識，概括了已知腫瘤細胞調控和改變線粒體功能的分子機制，總結了當前已有的靶向線粒體藥物，並展望了靶向腫瘤細胞線粒體藥物研發新方向[1]。本論文通訊作者為同濟大學施裕豐教授，第一作者為同濟大學醫學院劉玉娥博士。線粒體在腫瘤細胞能量供應、合成代謝、細胞存活和遷移等方面起重要作用，也是多種相關信號的調節器[2-3]，線粒體的這些功能和腫瘤細胞應對週圍環境息息相關，並在腫瘤幹細胞中顯得尤為重要。圖1Role of mitochondria in tumor癌基因功能增強或抑癌基因突變能直接或間接改變線粒體功能，引起線粒體重編程，促使正常體細胞向惡性腫瘤細胞轉化。該文章簡要概括了PI3K/Akt/mTORC信號通路、Tp53、以及Myc等腫瘤中常見癌基因和通路對線粒體功能的調控機制（圖2）。圖2 Mitochondria reprogramming in tumor因此，人們越來越認識到線粒體在腫瘤發生發展中的重要作用，提出了基于以線粒體腫瘤代謝物，生物合成，線粒體功能等為具體靶標的線粒體靶向腫瘤治療新策略。作者在該論文中總結了近年來靶向線粒體的抗癌藥物，及其作用靶點和相關進展（表1）。表1 Reagents targeting mitochondria for cancer therapy線粒體氧化磷酸化通路（OXPHOS）偶聯三羧酸循環和脂代謝等線粒體重要過程，是線粒體最核心的通路。近年來，

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已有多種靶向線粒體氧化磷酸化的小分子抑制劑在腫瘤細胞系、多種腫瘤模型和病人大數據中證明對腫瘤有效（圖3），並有一些小分子已進行臨床研究。圖3 Molecule targeting the mitochondrial OXPHOS pathway線粒體是維持細胞生存與功能至關重要的細胞器，

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致癌通路激活或抑癌基因功能丟失使線粒體發生重編程。線粒體代謝重編程對正常細胞向腫瘤細胞的轉化起重要作用，

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是腫瘤細胞在惡劣微環境下生存的重要條件。線粒體代謝重編程促進腫瘤生長，導致腫瘤轉移。同時，這些重編程的線粒體也揭示了癌細胞的脆弱性（vulnerabilities）所在，為研發可特異性抑制癌細胞內線粒體的抗癌藥物提供了方向和機會。因此，探索線粒體在不同腫瘤環境下的重組機制，

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找出其相應的脆弱點（vulnerability），將是下一代抗腫瘤藥物的研發方向。參考文獻：[1] Liu Y錛 Shi Y. Mitochondria as a target in cancer treatment. MedComm. 2020;1C11. https://doi.org/10.1002/mco2.16[2] Shi Y錛 Lim SK錛 Liang Q錛 et al. Gboxin is an oxidative phosphorylation inhibitor that targets glioblastoma. Nature. 2019;567(7748):341-346.[3] Llambi F錛 Wang YM錛 Victor B錛 et al. BOK is a non-canonical BCL-2 family effector of apoptosis regulated by ER-associated degradation. Cell. 2016;165(2):421-433.引用本篇論文:Liu Y錛 Shi Y. Mitochondria as a target in cancer treatment. MedComm. 2020;1C11. https://doi.org/10.1002/mco2.16點擊鏈接可閱讀本文全部內容：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/mco2.16＊中文翻譯僅供參考，所有內容以英文原文為準。通訊作者簡介：施裕豐教授施裕豐，同濟大學特聘教授，曾先後在美國康奈爾大學、紀念斯隆凱特琳癌症中心工作，曾入選“上海市海外高層次人才引進計劃”，“同濟大學傑出青年基金培育計劃” 等人才計劃。同濟大學施裕豐課題組主要研究方向為線粒體代謝與腫瘤發生發展之間的關系，以神經膠質瘤為模型，研究腫瘤細胞對線粒體功能依賴的分子機制和線粒體上抗腫瘤可成藥靶點。課題組現招聘副研究員、助理研究員和博士後（聯系郵箱：yshi@tongji.edu.cn）。關于 MedComm：MedComm是科研和教育領域的全球領導者──Wiley公司出版發行的全英文生物醫學專業期刊（https://onlinelibrary.wiley.com/journal/26882663）。主編由英國牛津大學James Henderson Naismith教授（英國皇家科學院院士、英國皇家愛丁堡科學院院士）和四川大學華西醫院生物治療國家重點實驗室魏于全教授/中國科學院院士擔任，

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副主編與編委由全球10多個國家的著名科學家構成。MedComm是同行評審的在線發表開放獲取 (OA) 期刊，及時出版關于生物醫學領域的基礎研究與臨床研究方面的工作，力爭成為生物醫學領域中具有國際影響力的高質量SCI學術期刊。本期刊發表論文類型包括綜述（Review）、展望（Perspective）、研究論文（Research Article）、致編輯信函（Letter）、研究亮點（Research Highlight）等，對于原創性成果採取“快速通道”模式，

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